多聚半乳糖醛酸酶（PG），能降解果胶使细胞壁破损．番茄果实成熟中，PG合成显著增加，能使果实交红变软，但不利于保鲜，可利用基因工程的方法以其进行改造．请据图1回答：（1）提取

Question

多聚半乳糖醛酸酶（PG），能降解果胶使细胞壁破损．番茄果实成熟中，PG合成显著增加，能使果实交红变软，但不利于保鲜，可利用基因工程的方法以其进行改造．请据图1回答：

（1）提取目的基因
①若已获取PG的mRNA，可通过______获取PG基因．
②在该基因上游加结构A可确保基因的反义转录，结构A上应具有______酶结合位点．得到的目的基因两侧需人工合成BamHI黏性末端．已知BamHⅠ的识别序列如图2-甲所示，请在图2-乙相应位置上，画出目的基因两侧的黏性末端______．
③重组质粒转化到大肠杆菌中的目的是______．
（2）用含目的基因的农秆菌感染番茄原生质体后，可用培养基进行筛选．培养24-48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞______现象来鉴别细胞壁是否再生．
（3）由于导入的目的基因能转录反义RNA，且能与______互补结合，抑制PG基因的正常表达．若转基因番茄的保质期比非转基因番茄______，则可确定转基因番茄成功．
（4）获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，科研人员常采用______技术手段使子代保持转基因的优良性状．
（5）改造过程需要的工具酶有______，如果在此过程中形成的是平末端，则起“缝合作用的酶是______．
（6）在构建基因表达载体时，除了插入目的基因外，基因表达载体中还需含有______，在该番茄薪品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做______．

Answer 1

（1）①已获取PG的mRNA，可通过逆转录或cDNA文库的方法获得目的基因．
②基因转录的产物是mRNA，在转录时需要RNA聚合酶．目的基因两侧的黏性末端如图：

③大肠杆菌繁殖快，因此将重组质粒转化到大肠杆菌中的目的是大量复制目的基因（克隆目的基因）．
（2）植物细胞在质量分数为25%的蔗糖溶液中会发生质壁分离现象，这可以用来鉴别细胞壁是否再生．
（3）反义RNA一般是指与编码链或有义链互补的DNA链编码的RNA，mRNA是由编码链或有义链编码的RNA，所以反义RNA和mRNA分子能互补成双链的RNA．由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译；若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长，则可确定转基因番茄成功．
（4）获得的转基因番茄产生的种子（是有性生殖的后代，会发生性状分离）不一定保留目的基因，故要保持该优良性状，可采用无性生殖即植物组织培养的方法．
（5）改造过程需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶；DNA连接酶分为E．coliDNA连接酶和T₄4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T₄4DNA连接酶还可以连接平末端．
（6）基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法．
故答案为：
（1）①逆转录（或cDNA文库）
②RNA聚合酶       
③大量复制目的基因（克隆目的基因）
（2）是否发生质壁分离
（3）天然PG基因转录的mRNA      长
（4）植物组织培养
（5）限制酶和DNA连接酶    T₄4DNA连接酶
（6）启动子、终止子、标记基因、复制原点     农杆菌转化法