研究发现，斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，为了研究该基因转录起始位点上游的部分序列对该基因表达的影响，科研人员做了如下实验．（1）为确定HuC基因的转录起始位

Question

研究发现，斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，为了研究该基因转录起始位点上游的部分序列对该基因表达的影响，科研人员做了如下实验．
（1）为确定HuC基因的转录起始位点，提取斑马鱼早期胚胎神经细胞的总RNA，以与___互补的一段单链DNA序列作为义务引物，加入___酶，获得cDNA．对该cDNA的序列进行测定，与HuC基因的序列比对，确定转录起始位点，定为+1号碱基，其上游的碱基定为负值．
（2）为了探究转录起始位点上游不同长度片段在基因转录中的作用，科研人员从___（选填“基因组”或“cDNA”）文库中获取该转录起始位点上游的片段，用___酶处理此片段和含GFP（绿色荧光蛋白）基因的载体，获得重组DNA分子．
（3）用不同种类的限制酶重复步骤（2），获得不同长度的重组DNA分子，通过显微注射方法分别导入斑马鱼的___细胞，通过荧光显微观察早期胚胎神经细胞肌肉细胞中的荧光强度，结果如图所示．

①获得图中所示的重组DNA分子，需要用到的限制酶没有___种．
②据图分析，缺失HuC基因上游的___片段就会造成HuC基因在所有细胞中表达被完全抑制．-1962bp至-432bp片段的存在会___HuC基因在肌肉细胞中的表达，对神经细胞中的表达___．

Answer 1

（1）由题意知，研究HuC基因的转录起始位点的方法是通过逆转录形成cDNA，然后与HuC基因的序列比对进行确定，因此选择逆转录的模板应该是HuC基因转录形成的mRNA，引物为与HuCmRNA互补的一段单链DNA序列，逆转录过程需要加入逆转录酶进行催化．
（2）探究转录起始位点上游不同长度片段在基因转录中的作用，应从基因组文库中进行选择该转录起始位点上游的不同长度的片段；基因重组技术所用到的酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶．
（3）重组DNA分子导入动物细胞常用的方法是显微注射法，常用的受体细胞是受精卵．
①DNA重组过程中需要用限制性内切酶切割DNA分子和目的基因，由题图可知，获取-1162bp～-1bp与获取-2771bp～-1163bp的酶相同、获取-431～-1bp与-2771bp～-432bp酶相同，-251bp～-2771bp～-252bp酶相同，因此得图中所示的重组DNA分子，需要用到的限制酶有7种．
②由题图可知，缺失HuC基因上游的-251bp至-1bp片段，神经细胞和肌肉细胞都没有绿色荧光，因此说明缺失HuC基因上游的-251bp至-1bp片段就会造成HuC基因在所有细胞中表达被完全抑制．-1962bp至-432bp片段的存在会部分抑制HuC基因在肌肉细胞中的表达，对神经细胞中的表达无显著影响．
故答案为：
（1）HuCmRNA    逆转录
（2）基因组          限制酶和DNA连接
（3）受精卵
①7
②-251bp至-1bp     部分抑制       无显著影响