紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用．研究人员从红豆杉中发现了一种具有产紫杉醇能力的内生真菌．为探究制备红豆杉内生真菌原生质体（不含细胞壁）的适宜pH和温度，进行了如下实验：①培

Question

紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用．研究人员从红豆杉中发现了一种具有产紫杉醇能力的内生真菌．为探究制备红豆杉内生真菌原生质体（不含细胞壁）的适宜pH和温度，进行了如下实验：①培养菌株，离心收集菌丝体，并用渗透压稳定剂洗涤两次；②将获得的菌丝体，分别置于不同pH或温度的培养液中，并加入适量酶液，震荡、摇匀后，每隔一段时间，取样、过滤、离心，用渗透压稳定剂洗涤两次后，收集纯化的原生质体．③统计原生质体数量，结果如下．

酶解温度（℃）	原生质体产量（×106个/mL）
25	12
28	22
32	31
35	26

分析回答：

（1）步骤②中，加酶液的目的是___，洗涤时选用渗透压稳定剂的理由是___．
（2）结果表明，制备红豆杉内生真菌原生质体的适宜条件是___、___．
（3）检验原生质体再生能力，需要配制再生固体培养基，培养基灭菌后需要冷却到___℃左右才能用来倒平板．
（4）实验中将收集到的原生质体浓度为30×10⁶个/mL培养液先稀释10⁴倍，再各取0.1mL稀释液分别均匀涂布在3个再生固体培养基上培养．一段时间后，统计得到的菌落数分别为：27、21、24．则原生质体再生率（能再生的原生质体数占全部原生质体的比例）约为___．

Answer 1

（1）原生质体是没有细胞壁的活细胞，而真菌有细胞壁，步骤②中加酶后可去除内生真菌的细胞壁，获得真菌的原生质体；真菌的细胞壁在洗涤时容易遭到破坏，洗涤时选用渗透压稳定剂可维持原生质体的正常形态，防止其破裂．
（2）由题图和题表可知，制备红豆杉内生真菌原生质体的适宜条件有：温度为32℃、pH为5、酶解时间3～4小时（或酶解时间3.5小时左右）．
（3）培养基灭菌后需要冷却后才能倒平板，倒平板时培养基的温度要下降到不烫手，大约在50℃．
（4）实验中将收集到的原生质体浓度为30×10⁶个/mL培养液先稀释l0⁴倍，原生质体浓度为3000个/mL，取0.1mL稀释液，得到30个．但实际测得是27、21、24．平均值是24，所以原生质体再生率=24÷0.1÷3000=0.08=8%．
故答案为：
（1）去除内生真菌的细胞壁     维持原生质体的正常形态，防止其破裂
（2）温度为32℃pH为5     酶解时间3～4小时（或酶解时间3.5小时左右）
（3）50℃
（4）8%