（2012•普陀区二模）下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题．资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲

Question

（2012•普陀区二模）下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题．

资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时AOX1基因能受甲醇诱导而表达【5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子】．
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达．
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上______、______限制酶识别序列，这样设计的优点是______．
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用______将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取______．
（3）步骤3中应选用限制酶______来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞．
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入______以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用分子杂交方法进行检测．
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达．
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行______并分泌到细胞外，便于提取．
（7）若某种限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端为则该酶识别的核苷酸序列是______．

Answer 1

（1）图中质粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上．如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaB、AvrⅡ限制酶识别序列．这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接．
（2）获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒．
（3）步骤3是要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞．
（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，则导入重组质粒的大肠杆菌能抗卡那霉素，所以为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡那霉素以便筛选．转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子杂交方法进行检测．
（5）巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达．所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达．
（6）细菌是原核生物，只含核糖体一种细胞器，而酵母菌是真核生物，除含有核糖体外，还含有内质网、高尔基体等细胞器．所以与细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行加工（修饰）并分泌到细胞外，便于提取．
（7）限制酶识别的序列一般是回文系列，若某种限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端为，则该酶识别的核苷酸序列是GACGTC．
故答案：（1）SnaB   AvrⅡ避免质粒和目的基因自身环化；
（2）DNA连接酶     大量重组质粒
（3）BglⅡ
（4）卡拉霉素
（5）甲醇
（6）加工（修饰）
（7）GACGTC