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DNASequencing的基本方法有哪些,其基本原理如何?
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DNA Sequencing 的基本方法有哪些,其基本原理如何?
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DNA测序技术,即测定DNA序列的技术.在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础.目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法.这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列.目前 Sanger测序法得到了广泛的应用.
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物.直到掺入一种链终止核苷酸为止.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP).由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止.终止点由反应中相应的双脱氧而定.每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物.它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测.
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物.直到掺入一种链终止核苷酸为止.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP).由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止.终止点由反应中相应的双脱氧而定.每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物.它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测.
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