检测目的基因是否表达,抗原抗体杂交法是什么原理,怎么回事啊?

Question

检测目的基因是否表达,抗原抗体杂交法是什么原理,怎么回事啊?

Answer 1

抗原抗体杂交就是Western杂交,原理
　　Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法.其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白.先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上,接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其非特异性位点.然后加入特异抗性体（一抗）,膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）,最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测.根据检测结果,从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况.
　　Western 杂交技术是一种蛋白质的固定和分析技术,是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上,固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力,所以能与特异性抗体或核酸结合,其程序Southern Blot相似,故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后,再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测,此方法可检测1ng抗原蛋白.Western杂交方法灵敏度高,通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白.
试剂配制
　　(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
　　150mmol/L 甘氨酸
　　加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中,加入1200mL
　　甲醇,加水至6L
　　(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S
　　1%乙酸
操作步骤：
　　(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶.
　　(2)用一张滤纸,剪成与胶同样大小,在转移电泳缓冲液中预湿,放在Scotch-Brit Pad上,在胶的阴性端放上滤纸,胶的表面用该缓冲液浸湿,排出所有气泡.
　　(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜,排出气泡,再在滤膜的阳极端放置一张滤纸,排出气泡,再放一个Scotch-Brit Pad.
　　(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间,将支撑物放入电转移装置中,加入电转移缓冲液.
　　(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上,电压为14V 4℃转移4小时或过夜.
　　(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟,蛋白染色水中脱色2分钟,照像,用印度墨水将分子量标准染色,在水中完全脱色.
　　(7)将滤膜放在塑料袋中,每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中),封闭特异性抗体结合位点,室温1h,摇动,倒出封闭缓冲液.
　　(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体,加入后室温放置1小时,将滤膜转到塑料盒中,用200mL PBS洗四次,摇动.
　　(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗,重复步骤8.
　　(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中,大约2～3分钟就可显色,用水冲洗终止反应、照像.
　　结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小,而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量.