关于定量PCR荧光信号强度荧光定量PCR中荧光信号强度不是越大越好,因为它有个可信范围,超过那个范围就不准了,请问这个可信范围是多少?

Question

关于定量PCR荧光信号强度
荧光定量PCR中荧光信号强度不是越大越好,因为它有个可信范围,超过那个范围就不准了,请问这个可信范围是多少?

Answer 1

常规PCR中,在扩增反应结束之后,我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,无法对PCR扩增反应进行实时检测,也无法对起始模板准确定量,而很多情况下,我们所感兴趣的是起始模板量,如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等,如此,荧光定量PCR技术便应运而生.
1、荧光定量PCR概念
所谓定量PCR技术（real-time PCR）,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法
2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别
理论上PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线.这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓.当所有的Taq酶都被饱和以后,PCR就进入了平台期.由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制.所以,即使是96次PCR重复实验,各种条件基本一致,所得结果有很大差异（如下图）,所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数.
荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）,荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期.在基线期,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化.而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加.由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数.只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析.
3．2荧光阈值
我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline,基线期）,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖.荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）.我们在做荧光定量PCR实验时,经常采用手动设置,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,真正的信号是荧光信号超过域值.
在荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加.每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图一般而言,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 ,荧光信号指数扩增阶段和平台期.在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化.而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加.PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数.只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析.为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值.荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍.每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）
CT 值与起始模板的关系研究表明,每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT 值越小.利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表 Ct 值.因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.