图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：（1）若图2中目的基因D是人的α-抗胰蛋白酶的基因，现在要培养乳汁中含α-抗胰蛋白酶的羊，科学家要将该基因通过（方法

Question

图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：

（1）若图2中目的基因D是人的α-抗胰蛋白酶的基因，现在要培养乳汁中含α-抗胰蛋白酶的羊，科学家要将该基因通过___（方法）注入羊的___中，发育完全的母羊有可能分泌含α-抗胰蛋白酶的乳汁．
（2）图2中的目的基因D需要同时使用MestI和PstI才能获得，而图1所示的质粒无限制酶MestI的酶切位点．所以在用该质粒和目的基因构建重组质粒时，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶切位点．试帮助完成构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件）：首先用___酶处理质粒；然后用___处理质粒，使被切开的质量末端链接上相应的脱氧核苷酸；再用 处理质粒形成限制酶切位点，它可被___识别．（供选答案如下：①EcoRI ②MestI ③PstI ④DNA连接酶 ⑤DNA聚合酶）
（3）假设图1质粒上还有一个PstI的识别序列，现用EcoRI、PstI单独或联合切割同一质粒，得到的DNA长度片段如表．请在图3中画出质粒上EcoRI和PstI的切割位点．（标出酶切位点之间的长度）___

酶	DNA片段长度（kb：碱基对）
EcoRI	14kb
PstI	2.5kb、11.5kb
EcoRI+PstI	2.5kb、5.5kb、6.0kb

Answer 1

（1）在动物基因工程中，一般选用受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因注入受精卵中．
（2）根据题意可知，图2中的目的基因D需要同时使用MestI和PstI才能获得，而图1所示的质粒无限制酶MestI的酶切位点．所以在用该质粒和目的基因构建重组质粒时，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶切位点：由于质粒上没有②③两种限制酶切割位点，因此需要首先用①酶（EcoRI）处理质粒；然后用⑤DNA聚合酶处理质粒，使被切开的质量末端链接上相应的脱氧核苷酸；再④DNA连接酶用处理质粒形成限制酶切位点，它可被②MestI识别．
（3）分析表格，利用EcoRI单独切割质粒产生的DNA片段长度为14kb，说明质粒共有14kb个碱基对，并且该酶具有一个该酶的限制酶切割位点；利用PstI单独切割形成2.5kb、11.5kb两个不同的片段，说明质粒上存在两个PstI的切割位点；而EcoRI+PstI共同切割时，11.5kb的片段又被切割成5.5kb、6.0kb两个片段，由此可以确定限制酶切割位点的位置．
故答案为：
（1）显微注射法        受精卵
（2）①⑤④②
（3）如下图所示：