在固体培养基中加入溶解性差、但可被微生物利用的酪蛋白，形成浑浊、不透明的培养基背景．当培养基中的酪蛋白被微生物分泌的蛋白酶分解后，菌落（沉淀圈）的周围就会形成透明圈（

Question

在固体培养基中加入溶解性差、但可被微生物利用的酪蛋白，形成浑浊、不透明的培养基背景．当培养基中的酪蛋白被微生物分泌的蛋白酶分解后，菌落（沉淀圈）的周围就会形成透明圈（如右图）．透明圈的大小反映了菌落利用蛋白质的能力．利用这种培养基可以筛选产蛋白酶菌株．下面是生物研究小组从土壤中筛选产蛋白酶菌株的方案．请协助完成方案，并回答有关问题：
实验步骤：
第一步：制备固体平板培养基：计算→称量→溶化→调pH→___→___．
第二步：运用稀释涂布平板法分离纯化菌株：分别梯度稀释制备土壤浸出液，吸取少量的土壤浸出液，注入培养基平板中，涂布均匀．然后置于温度28℃的恒温箱中，培养36h．
第三步：初筛菌种：从上一步培养基平板上挑选单细胞菌落，分别接种于筛选培养基中，在28℃下培养48h．挑选透明圈大而沉淀圈小的菌株，作为初筛菌株．
回答下列问题：

（1）补全“制备微生物固体培养基”的主要操作步骤①___，②___．
（2）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是___；灭菌后的培养基应适当冷却到___后，在酒精灯附近倒平板．
（3）“菌落”在生态学上属于___层次的生命系统，“稀释涂布平板法”纯化菌种的原理是在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成___，从而能够在培养基表面形成单个的菌落．
（4）初筛菌株的菌落周围“透明圈大”说明沉淀圈中的微生物分泌的蛋白酶活性___．
（5）为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌落生长，最可能的原因是___．
（6）研究人员将初筛菌株接种于发酵液中，在适宜条件下培养，并每隔一定时间取样检测发酵液中蛋白酶的活性，最终发现在培养的早期，发酵液中蛋白酶活性迅速升高，这可能与___有关．

Answer 1

（1）制备固体平板培养基的主要操作步骤是：计算、称量、溶化、调整pH、灭菌和倒平板．
（2）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）．灭菌后的培养基应适当冷却到50℃左右后倒平板．
（3）菌落属于种群．“稀释涂布平板法”纯化菌种的原理是在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能够在培养基表面形成单个的菌落．
（4）根据题意可知，透明圈大说明沉淀圈中的微生物分泌的蛋白酶活性高．
（5）题目中可能的原因是接种环温度过高，菌被杀死，结果导致其中一块平板的各划线区均未见菌落生长．
（6）在培养的早期，发酵液中蛋白酶活性迅速升高，这可能与培养液中菌株数量增加、分泌的蛋白酶增多有关．
故答案为：
（1）①灭菌       ②倒平板      
（2）干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）    50℃
（3）种群    单个细胞     
（4）高     
（5）接种环温度过高，菌被杀死     
（6）培养液中菌株数量增加、分泌的蛋白酶增多