我通过用T-DNA激活标签（35S）插入突变获得抗旱相关突变体,最后确定了T-DNA附近的A、B、C、D四个候选基因,将这四个候选基因分别构建过表达载体,最后得到A、B、C、D四个候选基因的过表达转

Question

我通过用T-DNA激活标签（35S）插入突变获得抗旱相关突变体,最后确定了T-DNA附近的A、B、C、D四个候选基因,将这四个候选基因分别构建过表达载体,最后得到A、B、C、D四个候选基因的过表达转基因T0苗各30株.
我的目的是要验证这些候选基因哪个是真的跟抗旱相关,请问：
1）我应该用这些过表达的T0苗来做干旱试验?还是用T0繁种得到的T1,然后用过表达的T1来做干旱试验?还是用过表达的T2来做干旱试验?为什么?
2）如果用T0或T1苗来做验证?需要多少株苗?为什么?（比如我用了30株过表达基因A的T0苗做实验,结果有7株抗旱,23株不抗旱,那怎么去分析这个结果,这个基因A与抗旱相关的吗?如果结果是有23株抗旱,7株不抗旱或者是15株抗旱15株不抗旱,这个结果又该怎么分析呢?）
3）如果用过表达的T2来做实验,由于在T2已经分离了,所以T2植株会有过表达的纯合子和过表达的杂合子,用这个过表达的纯合子和过表达的杂合子做实验有什么区别?

Answer 1

不同作物的转基因所说的T0、T1、T2是不一样的.以A基因、T0为Aa为例.用T0肯定不行,因为你T0代你无法知道转基因的拷贝数,而过表达、拷贝数过多的话会产生共抑制的情况,反而会抑制原本A基因的正常表达,所以T0（Aa）代主要是鉴定拷贝数用,确定单拷贝的株系(southern).T0代结的种子,也就是T1代的苗子会有分离的情况(AA、Aa、aa),这一代主要是筛选AA的纯系,具体的做法是结合你转基因质粒上的抗性,田间筛选,收获T1有抗性株系的所有种子（长大为T2代植株）,把这些种子种下去即T2代植株,T2代苗期抗生素筛选,选取抗性没有分离、全部抗的株系的种子,即存系的AA,这些长大的苗子（T2）才可以用来做抗旱分析,抗或者不抗一目了然,对照为你在T1代田间筛选时没有抗性的aa植株或者野生型.所以应该用T2的苗做实验.（SCI发表得结果都是要筛到纯系之后）