生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗，科学家发现，在微生物M（单细胞）产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如

Question

生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗，科学家发现，在微生物M（单细胞）产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如图1）．

（1）筛选产脂肪酶的微生物M时，选择培养基中添加的植物油为微生物生长提供______，培养基灭菌采用的最适方法是______法．
（2）图3是采用纯化微生物M培养的两种接种方法接种后培养的效果图．则获得图A效果的接种方法是______，图B效果的接种方法是______．
（3）若需人工大量克隆脂肪酶基因，可应用_______技术，该过程需要的特殊酶是______．
（4）常用血球计数板（规格为1mm×1mm×0.1mm）分两类，一类是每个计数室包括16个中格，每个中格包括25个小格，这种计数板抽样计数时只要统计四个顶角的中格即可；另一类是每个计数室包括25个中格，每个中格包括16个小格，这种计数板抽样计数时除了统计四个顶角的中格外还要计数中央的一个中格．在实验中如需定期测定培养液中微生物M的细胞数量，则在取出的样液中要立即加入固定液，其目的是______．如果将样液稀释100倍，采用血球计数板计数时，观察到的计数室中细胞分布如图2所示，则培养液中微生物M的 细胞密度为______个/L．
（5）研究人员拟将某目的基因导入微生物M 细胞中，为此需要选择合适的质粒作为运载体．图4所示X-1、X-2、X-3、X-4为四种相关质粒，其中Tc^r表示抗四环素的抗性基因，Ap^r表示青霉素抗性基因，E1和E2表示两种限制酶的识别位点．基因工程中限制酶作用的化学键是______．若将这四种质粒分别导入微生物M，然后将微生物M菌液分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上培养．则在这两种培养基上均不能生长的M细胞类型有______．
（6）已知Tc^r长度为1.5kb（1kb=1000个碱基对），Ap^r长度为0.5kb．如果X-1用E1酶切，产生0.5kb碱基片段和8.5kb碱基片段，那么质粒X-2用E2酶切后的片段长度为______对碱基

Answer 1

（1）植物油由C、H、O三种元素构成，微生物通常以此作为碳源；培养基常规的灭菌方法是高压蒸汽灭菌．
（2）获得图A效果的接种方法是稀释涂布平板法，图B效果的接种方法是平板划线法．
（3）基因的扩增通常采用PCR技术，需要耐热DNA聚合酶．
（4）为了防止细胞因自身的增殖周期而影响计数效果，需要加入固定液杀死固定微生物M细胞．该血球计数板规格为1mm×1mm×0.1mm，并且是25×16型的，可采用五点取样法，即取四角和最中间的5个中方格（80个小方格）计数，并采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，共计数了酵母菌5+4+4+4+3=20个．计数室共分了400个小方格，其容积共有1mm×1mm×0.1mm=0.1mm³=1×10^-4mL，所以可以计算出1mL有酵母菌(20)/(80)×400×10⁴×100（稀释的倍数）=10⁸个，则1L有酵母菌10⁸×1000=10¹¹个．
（5）基因工程中限制酶作用的化学键是磷酸二酯键，X-1用E2切可以在有青霉素的培养基上生长；X-2用E2切可以在有四环素的培养基上生长；X-3不含有抗性基因都不能生长；X-4用E1切可以在含有四环素的培养基上生长，用E2切可以在有青霉素的培养基上生长．
（6）如果X-1用E1酶切，产生0.5kb碱基片段和8.5kb碱基片段，则总长为9Kb．当Ap^r长度为0.5kb，质粒总长为9Kb，则Tc^r长度为1.5kb时，X-2总长为10Kb（1kb=1000个碱基对），即10000个对碱基．
故答案为：
（1）唯一碳源   高压蒸汽灭菌   
（2）稀释涂布平板法   平板划线法
（3）PCR  耐热DNA聚合酶   
（4）防止细胞因自身的增殖周期而影响计数效果，因此要杀死固定微生物M细胞      10¹¹
（5）磷酸二酯    无质粒细胞含X-3的细胞
（6）10000