生物酵母菌培养实验数酵母菌的时候有哪些注意事项?

Question

生物酵母菌培养实验数酵母菌的时候有哪些注意事项?

Answer 1

一、实验目的
1、学会测微尺和血球计数板的使用方法.
2、建立对微生物大小的概念.
二、实验材料
　　1、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数 板、载玻片等.
2、麦芽汁培养基、酵母菌.
3、吸管、吸水纸等.
三、实验原理
(一)酵母菌大小的测定原理
　　所有微生物的大小需要用刻有一定刻度的测微尺来测量,先用绝对长度的物镜测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺,计算后者每格所代表的实际长度,然后放上待测的标本,用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数,就可计算该微生物的大小.酵母菌的直径约8-10μm.
(二)酵母细胞计数原理
　　微生物常用的计数方法有两种,即直接计数法和间接计数法.前者利用血球计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内.后者是在乎板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长.本实验是利用血球计数板进行直接计数.计数前需对样品做适当稀释,按照规定方法及计算公式运算后,即可得出实际数值.
四、操作方法
(一)酵母菌大小测定的操作方法
1.测微尺的构造和使用方法
　　(1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻片,其中央刻有精确的刻度,通常是将5mm划分为50格,实际每格等于100μm.刻度的大小是随使用的接目镜和接物镜的放大倍数而改变,用前必须用物镜测微尺来标定,如图.
　　(2)物镜测微尺的构造 物镜测微尺为一块特制的载玻片,其中央有一小圆圈.圆圈内刻有分度,将长1mm的直线等分为100小格,每小格等于10μm,如图.
2.目镜测微尺的标定
　　(1)取下接目镜,旋下目镜上的目透镜,将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上,使有刻度的一面朝下,再旋上目透镜,并装入镜筒内.
　　(2)将物镜测微尺置于显微镜的载物台上,使有刻度的一面朝上,同观察标本一样,使具有刻度的小圆圈位于视野中央.
　　(3)先用低倍镜观察,对准焦距,待看清物镜测微尺的刻度后,转动目镜,使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行,并使两尺的左边第一条线相重合,再向右寻找两尺的另外一条重合线.如图
　　(4)记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数.
3.计算方式 (1)目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10／两个重叠刻度间目镜测微尺格数
　　(2)以同样方法,分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度.
目镜测微尺( )格=物镜测微尺( )格
目镜测微尺每格=( )
　　(3)如此测定后的目镜测微尺的尺度,仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数.若更换物镜、目镜的放大倍数时,必须再进行校正标定.
4.酵母菌大小的测定
(1)取下物镜测微尺,换上酵母菌水浸制片.
　　(2)测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格,然后换算出菌体的实际长度.
(3)在同一标本上测定5-10个菌体,求其平均值.
(二)酵母细胞数的测定操作方法
1.血球计数板的构造
　　血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面个刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1m,深度为,其体积为0.1mm3.
　　计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图.
2.血球计数板的使用
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.
　　(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.
　　(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.
　　(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
　　(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.
　　(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).
　　(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.
3.计算公式 (1)16格×25格的血球计数板计算公式：
酵母细胞数／ml=100小格内酵母细胞个数／100×400×104×稀释倍数
(2)25格x16格的血球计数板计算公式：
酵母细胞数／ml=80小格内酵母细胞个数／80×400×104×稀释倍数
4.血球计数板的清洁
　　血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.
五、思考题及实验作业
　　1.若更换不同放大倍数的目镜和物镜时,必须用物镜测微尺标定目镜测微尺,这是为什么
2.利用血球计数板时,注入的菌液为什么不能过多