如何测量氨基酸的排列顺序?

Question

如何测量氨基酸的排列顺序?

Answer 1

测定肽或蛋白质中各氨基酸的排列顺序 在分析氨基酸后下一步就是要测定肽链或蛋白质中氨基酸的结合顺序，通常可由下列几种方法配合使用分析推测出来： （1）N-端氨基酸单元的分析：最常用的有下列两种方法： （a）桑格尔方法： 详细内容 这项方法首先是桑格尔（Sauger，F．）提出的，他利用氨基很容易和2，4-二硝基氟氯苯（DNP）发生芳香亲核取代反应，如用一个肽和2,4-二硝基氟苯反应，显然键的N-端游离氨基和它反应，然后把这个N-端带有2,4-二硝基苯基的肽链彻底水解，在水解物中，只有一个氨基酸的α-氨基的氢被DNP取代，各种氨基酸的DNP标记化合物都是黄色的，并且都各有一个Rf值，因此很容易鉴别；所以通过这个方法，很容易辨认出肽中的N-端是哪一个氨基酸。 （b）艾德满方法： 详细内容 另一种标记N-端的氨基方法叫作文德满（Edman.P.）方法，用异硫氰酸苯酯和N-端的氨基反应，生成苯胺基硫代甲酸衍生物。该化合物在无水氯化氢作用下，发生一种关环作用，形成一个苯基乙内酰硫脲的衍生物，从肽链上断裂下来，而肽链中的酰氨键不受影响。 一个肽链经上列的反应后，其结果是失去一个N-端的氨基酸，这个氨基酸可以作为取代苯基乙内酸硫脲进行鉴定。失去一个氨基酸的肽键还可以收回，再重复上面的反应，进行第二个N-端的标记。这种方法已经可以自动化。假若肽键不是太长的话，一般讲这个方法是可靠的。 （2）c-端氨基酸单元的分析： c-端的氨基酸单元可以通过羧肽酶催化水解，羧肽酶可以选择性切断游离羧基相邻的肽键，在溶液中切断下来的氨基酸是C-端位置的，已切断了c-端氨基酸的肽键。再与羧肽酶作用，如此不断进行，可以使整个多肽或蛋白质水解为氨基酸。根据氨基酸出现的时间，可以推断C-端氨基酸的排列顺序。实际上此法最多只能鉴定3～4个氨基酸，因此对于长链用处不大，可用于小肽（二肽、三肽等）C-端氨基酸顺序鉴定。 （3）用酶催化使肽键部分水解: 测定肽键氨基顺序的一个关键是部分分解，将一个长的肽键分解为许多小肽，然后将这些小肽分离，再进行氨基酸分析，N-端基标记，这样多次地重复下去，最终得到整个肽链氨基酸的顺序。许多消化道内分泌出来的酶可以使肽键水解。有些酶的专一性并不很强，但是有些酶的水解是具有高度专一性的，不同的酶只能分解不同氨基酸的肽键。