下面是将乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题．资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生

Question

下面是将乙肝病毒控制合成的病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题．
资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，同时AOX1基因（醇氧化酶基因）受到诱导而表达，5'AOX1和3'AOXl（TT）是基因AOX1的启动子和终止子，此启动子也能使外源基因高效表达．
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，下图为科学家改造的pPIC9K质粒，其与目的基因形成的重组质粒在特定部位酶切后形成的重组DNA片段可以整合到酵母菌染色体上，最终实现目的基因的表达．

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上___限制酶识别序列（SnaB I、Avr II、SacI、Bgl II四种限制酶的识别序列均不相同），这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化．
（2）酶切获取HBsA9基因后，需用___将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，根据步骤②可知步骤①将重组质粒先导入大肠杆菌的目的是___．
（3）步骤3中应选用限制酶___来切割从大肠杆菌分离的重组质粒从而获得图中所示的重组DNA片段，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞．
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入___以便筛选．
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___以维持其生活，同时诱导HBsA9基因表达．
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___并分泌到细胞外，便于提取．
（7）培育转化酵母细胞所利用的遗传学原理是___．

Answer 1

（1）重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种内切酶对质粒和目的基因同时切割，便会各自出现相同的粘性末端，便于重组与表达．
（2）①用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒；步骤①将重组质粒先导入大肠杆菌体内，目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度，短时间内可获取大量的重组质粒．
（3）重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其它限制酶会破坏含有启动子、终止子的目的基因．
（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，则导入重组质粒的大肠杆菌能抗卡那霉素，所以为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡那霉素以便筛选．转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子杂交方法进行检测．
（5）巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达．所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达．
（6）酵母菌为真核生物，细胞内具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生物，不具有内质网和高尔基体等细胞器．
（7）培育转化酵母细胞所利用的遗传学原理是基因重组．
故答案为：
（1）SnaBⅠAvrⅡ避免质粒和目的基因自身环化（或任意连接）
（2）DNA连接酶　利用大肠杆菌无性繁殖速度，短时间内可获取大量的重组质粒
（3）BglⅡ
（4）卡拉霉素
（5）甲醇
（6）加工（修饰）
（7）基因重组