利用转基因奶牛乳腺生物反应器生产人的生长激素，需要构建一种能高水平表达的表达载体：选择合适的基因启动子至关重要．由于无法由基因表达产物推知启动子的碱基序列，运用PCR技术

Question

利用转基因奶牛乳腺生物反应器生产人的生长激素，需要构建一种能高水平表达的表达载体：选择合适的基因启动子至关重要．由于无法由基因表达产物推知启动子的碱基序列，运用PCR技术单独克隆启动子存在困难．科研人员经过长期研究，终于发明了下图所示的一种克隆启动子的方法．请回答：

（1）过程①需选择的限制酶是______，用该限制酶处理后将得到______个DNA片段，DNA会增加______个游离的磷酸基团．
（2）过程④需要使用的工具酶是______，过程④中可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列
设计______进行扩增．扩增过程中，在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
（3）如果是用PCR技术扩增目的基因，退火温度一般为55～60℃．对于（A十T）%＞50%，一般用55℃，（A+T）%≤50%时一般用60℃，原因是______．
（4）研究发现将真核生物的蛋白质基因导入了大肠杆菌菌株中，能正常转录形成了 mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性，最可能的原因是______．

Answer 1

（1）由图可知，过程①应用限制酶BamHI进行切割；用限制酶BamHI处理后将得到3个DNA片段，每个DNA片段含有2个游离的磷酸基团，因此共有6个磷酸基团，而原来DNA含有2个游离的磷酸基团，因此会增加4个游离的磷酸基团．
（2）过程④表示采用PCR技术进行体外扩增，该过程在较高的温度条件下进行，因此需要使用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）．由图可知，该过程可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列设计引物进行扩增．根据DNA分子半保留复制特点，扩增过程中，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
（3）G与C之间有三个氢键，而A和T之间有两个氢键，因此C和G的比例越高，DNA分子越稳定．
（4）将真核生物的蛋白质基因导入了大肠杆菌菌株中，能正常转录形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性，原因是大肠杆菌细胞属于原核细胞，缺乏内质网与高尔基体，不能对多肽链进行折叠、组装与修饰．
故答案为：
（1）BamHI  3  4  
（2）耐高温的DNA聚合酶（Tag酶）  引物   三
（3）G与C（之间是三个氢键）比例越高越稳定[或A与T（之间是二个氢键）比例越高越不稳定]
（4）大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体（或大肠杆菌缺乏生物膜系统），不能对多肽链进行折叠、组装与修饰