猪的肌肉生长抑制素（MSTN）基因可抑制肌细胞的增殖和分化．CRISPR/Cas9是一种最新出现的基因编辑技术，其主要过程是向导RNA（gRNA，含与目的基因部分序列配对的单链区）与Cas9核酸酶结合

Question

猪的肌肉生长抑制素（MSTN）基因可抑制肌细胞的增殖和分化．CRISPR/Cas9是一种最新出现的基因编辑技术，其主要过程是向导RNA（gRNA，含与目的基因部分序列配对的单链区）与Cas9核酸酶结合，引导Cas9核酸酶对DNA局部解旋并进行定点切割．科研人员利用该技术定向敲除猪胎儿成纤维细胞中MSTN基因，以期获得生长速度快、瘦肉率高的新品种．过程如图，其中BsmBI、Kpnl、EC0RI表示相应限制酶的识别位点．分析回答：

（1）图中①过程用到的工具酶有___，图中gRNA基因序列设计的主要依据是___．
（2）科研人员可利用___（方法）将重组质粒导入猪成纤维细胞，经___过程合成Cas9核酸酶．
（3）过程③与DNA复制相比，特有的碱基配对方式有___．
（4）分析发现某基因敲除细胞株中MSTN基因的表达水平为正常细胞的50%，说明___．
（5）欲利用MSTN基因缺失成纤维细胞培育成MSTN基因缺失猪，请简要写出基本的流程．___．

Answer 1

（1）图中①表示基因表达载体的构建过程，该过程首先要用同种限制酶切割外源DNA分子和运载体（普通质粒与重组质粒中的限制酶切割位点可知，这里使用的是BsmBI限制酶），其次要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成...