（2013•闵行区一模）基因工程操作步骤中，需要从受体细胞群中筛选出已获得目的基因的细胞，图1中①-③示一种筛选方法的过程．pBR322质粒含有两个抗性基因，分别是Amp（氨苄青霉素）抗

Question

（2013•闵行区一模）基因工程操作步骤中，需要从受体细胞群中筛选出已获得目的基因的细胞，图1中①-③示一种筛选方法的过程．pBR322质粒含有两个抗性基因，分别是Amp（氨苄青霉素）抗性基因和Tet（四环素）抗性基因，其中在Tet抗性基因上有下列目的基因的插入位点（插入将导致Tet抗性基因功能性失活），请回答：

（1）图1中①过程所需的酶是______．
（2）经过①过程，ρBR322质粒可能出现的两种结果A是______．
（3）②过程表示用含四环素（使细胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲，则培养结果C表示培养基中可以存活的细菌包括______．
（4）若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要做的处理是（请参照过程②的方法）______．
（5）基因工程中使用的Ⅱ型限制性核酸内切酶通常可以识别长度为4-8个核苷酸的特异序列．下面示限制酶Sau3AⅠ对DNA片段切割的结果．

请分析，Sau3AⅠ的识别序列以及切割位点（用“↓”表示）是______．
（6）下表列出了几种限制酶的识别序列及其切割位点，图2（含两个抗性基因的质粒）和图3（含目的基因的外源DNA）中箭头表示相关限制酶的酶切位点．

限制酶	XhoⅠ	BclⅠ	SalⅠ	BamHⅠ	XbaⅠ
识别序列及酶切位点	C↓TCGAG	T↓GATCA	G↓TCGAC	G↓GATCC	T↓CTAGA

据图2和图3分析，为了使目的基因和质粒实现定向连接和便于受体细胞的筛选，切割质粒的限制酶应选用______，切割含目的基因的外源DNA的酶应选用______．

Answer 1

（1）①过程为构建基因表达载体，需要对质粒进行切割和与目的基因相连接，所以要用限制酶和DNA连接酶；
（2）①为构建基因表达载体，会出现将目的基因与质粒成功重组和重组失败的结果，所以ρBR322会出现两种结果，重组质粒和未重组的质粒；
（3）细菌有三类：含有质粒（不是重组的）、含有重组质粒的、不含有质粒的．Tet抗性基因上有目的基因的插入位点，所以重组质粒上没有Tet抗性基因，成功导入重组质粒的细菌和没有导入的细菌均不含Tet抗性基因，即都不抗四环素，细胞可以在含四环素培养基上存活但不生长，而环丝氨酸会使生长的细胞致死，对不生长的细胞无影响，但会使含有抗四环素的细菌致死，所以C中成活的细菌有导入不成功的细菌和导入重组质粒的细菌．
（4）经过C后，现需要含重组质粒的细菌，含重组质粒的细菌含有Amp抗性基因，可在氨卡青霉素培养基中生长，而导入不成功的细菌会在其中死亡，所以可将经过C存活的细菌转入含氨卡青霉素的培养基中培养．
（5）根据图中切割位点T和G及结果知所识别的序列应为
（6）用XbaⅠ和BclⅠ既不破坏目的基因又可将其完整切下，而获取目的基因和重组质粒所用限制酶应保持一致
故答案为：
（1）限制酶和DNA连接酶；
（2）重组质粒和未重组质粒；
（3）含有重组质粒的细菌和导入不成功的细菌；
（4）将存活的细菌转入含氨卡青霉素的培养基中培养；
（5）；
（6）XbaⅠ和BclⅠXbaⅠ和BclⅠ