菌种选育中复筛的两种方法夹层法和点种法的方法步骤?

Question

菌种选育中复筛的两种方法夹层法和点种法的方法步骤?

Answer 1

生长谱测定的方法
将缺陷型菌株培养后,收集菌体,制备成细胞悬液,与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿.待凝固后,分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片.培养后会在某组合区长出,就可测得所需营养.一个平皿测一个菌.
以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿,然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置,培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子.在5－6个平皿上可测20株菌以上.
筛选结构类似物抗性突变株
结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物
特点：有反馈调节作用
无正常生理功能
筛选方法：浓度梯度法（补充）
黄色短杆菌的代谢过程
天冬氨酸 甲硫氨酸 苏氨酸
赖氨酸 天冬氨酸磷酸
天冬氨酸激酶
天冬氨酸β－半醛
抑制 高丝氨酸 高丝氨酸
脱氢酶(hom)
黄色短杆菌的代谢特点
天冬氨酸激酶（AK）,是一个变构酶,并有两个活性中心,分别受Lys、Thr的协同反馈抑制
协同反馈抑制：该酶有多个活性中心,抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合,但是并不影响该酶的活性,只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后,其活性才受到抑制.
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸-β-半醛
高丝氨酸 高丝氨酸磷酸
O-琥珀酸高丝氨酸
二氢吡啶-2,6-二羧酸
赖氨酸 苏氨酸 异亮氨酸
蛋氨酸 天冬氨酸 1 2
3 4 5 两个分支点的优先合成机制 ：
优先合成Hos,然后再优先合成Met
当Met过量时
阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶,使代谢流向合成Thr的方向进行
当Thr过量时
反馈抑制高丝氨酸脱氢酶,使代谢流向Lys的合成上.（Met＞Thr＞Lys）
育种途径 切断或减弱代谢支路
切断或减弱合成Met 、Thr的分支途径——选育营养缺陷型或渗漏突变株
A、需要选用HomL,其意义在于：
优先合成的转换：可引起一种终产物的过量生成.
高比活性的HD使Thr优先合成.若往培养基里添加过量的Met,将HD的活性控制在原来活性的1/3,在野生株中也能积累5g/L lys,进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3,可积累20g/L lys.
进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3,可积累20g/L lys.在这样低的比活性下,不添加Thr和Met,野生菌株也能正常生长.但如果单独过量添加一种Thr或Met,反而由于过剩的Thr或Met抑制或阻遏本来已经活力很低的HD使Thr或Met合成不足而抑制生长.
结果：由于HD活性下降但不完全丧失,使代谢流发生变化,使原来优先合成Hos方向转向合成lys方向.而Thr和Met少量合成,生成的Thr的量不足以与lys共同对AK酶起协同反馈抑制,就使lys得以积累.
B、需要选用Hom-,其意义在于：
解除了Hom的优先合成机制,阻断了代谢向Met、Thr的方向进行,节省了原料,可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上.
在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hom）,对于AK酶活性的调节有着重要意义.因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶,限制了其中某一个抑制物（Thr）,则Lys的浓度再高,也不会影响到AK酶的活性,那么,代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行,使得产物的合成畅通无阻.
双重营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质和Hom- 相同.
优点：遗传性质稳定,回复突变的几率少.
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
天冬氨酸 中间产物Ⅰ
天冬氨酸激酶
中间产物Ⅱ 甲硫氨酸
苏氨酸 高丝氨酸 高丝氨酸
脱氢酶 不能合成 可以大量积累
赖氨酸 人工诱变的 菌种不能产生
解除反馈调节（—反馈阻抑）
从理论上讲,选育Hom- 进行赖氨酸发酵,如果在其培养基中限量供给Thr,则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制,实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用.因此,对于黄色短杆菌的Lys发酵,仅仅选育Hom- 是不够的.为了高效率的转化Lys,需要解决这一问题：
是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力）,如何使其脱敏呢?
选育结构类似物抗性突变株?（X r）
S-L-半胱氨酸抗性突变株 AEC r （效果最佳,应用最广）
γ-甲基赖氨酸抗性突变株 ML r
L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHxr
苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr
L- Lys:CH2(NH2) -CH2-CH2-CH2-CH (NH2)COOH
AEC:CH2(NH2) -CH2-S-CH2-CH (NH2)COOH
结构类似物AEC物的作用机制：起假反馈抑制作用
　　AEC 与L- Lys结构相似,被天冬氨酸激酶所误认,与Thr一起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合,协同抑制酶活.
抗结构类似物突变株的实质：天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变.