要分离77KD和80KD的两个蛋白,要用多大浓度的SDS-PAGE胶能有较好的分辨率?我目前用的10%的胶能看出来大小差别,但是不太明显?如果跑的时间长些,条带就会糊掉.用浓度高些是不是会好些呢?kate_101

Question

要分离77KD和80KD的两个蛋白,要用多大浓度的SDS-PAGE胶能有较好的分辨率?
我目前用的10%的胶能看出来大小差别,但是不太明显?如果跑的时间长些,条带就会糊掉.用浓度高些是不是会好些呢?
kate_1018 我想问下如果用到12%的胶，跑的时间足够长，预染marker的位置和10%的达到同样位置的时候，这样两条带的差别还是会小于10%的胶吗？你说的“用好点的材料制备凝胶”，是说用好点的丙烯酰胺和甲叉吗？你说的“将电泳电压在后半程调高可改善条带清晰度”，是有实际经验的吗？还是理论上的？我一般都是 80浓缩

Answer 1

一般凝胶浓度低是容易出现条带模糊的情况.个人手法是：用好点的材料制备凝胶来进行分析.10%的浓度可以用来分离这两种蛋白,将电泳电压在后半程调高可改善条带清晰度.也可以调高分离胶浓度至12%,但差别会较10%的更小.是在不行可以考虑用梯度胶分.
“用好点的材料”是说的丙烯酰胺和甲叉.
“将电泳电压在后半程调高改善条带扩散”,我分离胶用135V,缩短电泳时间.
两种浓度的差别也不是太大.为了扩大差别,可以通过预染marker来控制电泳时间,将小分子的蛋白跑出去,用更多的凝胶长度来加大两者的差别.不过电泳时间延长对条带清晰程度会有影响.
样品的pH也会对条带的清晰程度有影响,以前做分子量和你的差不多大的酵母样时,条带就有些模糊.其实有时只要能将两者区分开,不一定非要追求最佳分离效果.
个人观点,仅供参考!