几种核酸杂交技术的比较 点杂交实验原理、步骤

Question

几种核酸杂交技术的比较 点杂交实验原理、步骤

Answer 1

并介绍了点杂交的基本概念及实验原理、方法.
几种核酸杂交技术的比较?点杂交实验原理、步骤
（1）几种核酸杂交的异同点
核酸杂交是分子生物学的基本技术,也是遗传学研究和基因诊断的常用方法.核酸杂交的形式有多种,其中最常用的是Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交等.虽然形式多样,但都是基于核酸分子的碱基互补原理.从杂交材料来看,杂交分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交.从杂交分子状态来看,杂交分为液相-固相杂交和液相-液相杂交.
上述几种杂交都属于液相-固相杂交,即将参与杂交的一方分子固定在固相的支持载体上,另一方分子以液相形式参与杂交.参与杂交的双方分子必有一方被标记,以便产生能够被检出的杂交信号;在液相-固相杂交中往往液相分子被标记,这样才能产生有意义的差别信号.在杂交在中,被标记的分子称为探针,而与探针进行杂交的分子称为被检测样品(被检分子).大多数液相-固相杂交中被检样品往往是混合分子,如提取的基因组DNA或某种组织的RNA,并且将被检样品固定在载体上,而探针往往是单一分子,如某一基因的片断.杂交结果是根据信号的强弱和位置进行判断,如被检分子的分子量(或长度),被检分子的表达强度等.这种杂交适用于相同基因片断对不同样品的检测.若进行一种样品被不同基因片断的检测时,就必须采取反向的方式,即将不同的基因片断固定在载体上,而将被检样品制成液相并进行标记.这种反向的方式称为反向杂交,反向杂交中被标记的样品也可以称为探针.
在液相-固相杂交中固相载体往往采用尼龙膜或醋酸纤维膜,这些经过特殊处理的材料对核酸分子具有强大的吸附力,在操作中不易脱落.探针标记往往采用放射性标记,如32P、35S等,由于放射性物质的危害性,现在非放射性标记也在广泛使用,如生物素标记、地高辛标记等.一般来说,放射性标记适用于Southern杂交、Northern杂交和点杂交,非放射性标记适用于原位杂交.放射性标记灵敏度高,线形范围宽,非放射性标记定位性强,没有衰变,危害小.
（2）点杂交的概念
点杂交(dot blot)是杂交信号呈现斑点样的杂交方法,在操作上是把参与杂交的一方分子点样到膜上.由于杂交分子预先没有进行像Southern杂交和Northern杂交之前的电泳分离,也没有像原位杂交那样,杂交一方的分子已经表现出组织细胞分布的位置特异性,所以点杂交的结果判断完全视杂交信号的强弱,其信息量没有其它杂交形式的信息量丰富.但点杂交的操作比较简单、结果直观、适用于大批样品的检测,因此它在许多方面也得到了广泛的应用.
一、实验目的
理解核酸杂交原理;熟悉核酸杂交的一般方法,掌握膜斑点杂交技术和结果分析.
二、实验原理
点杂交是核酸杂交中比较简单的一种技术,本质上也是单链核酸分子通过碱基互补而形成双链核酸的过程,当某单链分子被标记后,就可以检测与其互补的分子.
(一)印迹印迹(blot)就是将杂交一方的分子固定在膜上,对于Southern杂交和Northern杂交,往往采用毛细转移,真空转移或电转移等方法,使电泳分离的核酸分子“原位印迹”到膜上去,而点杂交则可采取人工点样的方法,将核酸分子固定到膜上去.在点膜时还要借助其它使核酸分子固定的方法(如点膜器、真空抽气装置)使分子更紧密地结合在膜上,并且不扩散.点杂交的印迹过程提供了一个固化平台和阵列,使杂交在已知位置上进行.
(二)标记标记(labeling)就是使参与杂交的一方分子带有可识别的物质,使杂交后显示信号.常用标记物有放射性同位素和非放射性物质,标记方法有随机引物标记法、缺口平移法和末端标记法等.在液相-固相杂交中,标记往往在液相分子上,使探针成为流动相.标记效率是影响杂交的重要因素,在一定范围内,比活性(可以理解为单位分子中的标记物数量与活性)越高越好.在杂交中,探针往往是过量的(杂交信号的强弱反映的是被检样品的量和基因丰度),所以依靠增加探针量来提高杂交灵敏度的做法很有限的,应该提高探针的比活性.