p53基因是人体内一种抑癌基因．该基因编码的p53蛋白可对癌变前的DNA损伤进行修复，使其恢复正常，或诱导其进入休眠状态或细胞凋亡，阻止细胞癌变．“今又生”是我国首创的基因治疗药

Question

p53基因是人体内一种抑癌基因．该基因编码的p53蛋白可对癌变前的DNA损伤进行修复，使其恢复正常，或诱导其进入休眠状态或细胞凋亡，阻止细胞癌变．“今又生”是我国首创的基因治疗药物之一，是世界首个获准上市的基因治疗药物，其核心成分是利用腺病毒和人p53基因拼装得到的重组病毒．“今又生”药物中的腺病毒经基因工程改造后，在宿主细胞内不能复制，不能整合到染色体上．请回答下列问题：
（l）将p53基因与腺病毒拼装成重组病毒，需要用到的工具酶有___．常用的基因工程载体除动植物病毒外，还有___．
（2）限制酶能将特定序列的核苷酸之间的___键切开，形成___末端．
（3）在“今义生”的生产中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的___，以获得更高的安全性能．p53基因应插入载体的___之间，以便于基因的表达．
（4）p53基因的大量扩增可以采用PCR技术，该技术中需使用的一种特殊的酶是___．如图是需要扩增的p53基因在DNA中的位置示意图，扩增过程需要___种引物．n次循环之后，只含目的基因的片段占所有扩增产物的比例为___．

Answer 1

（1）腺病毒可作为运载体，将p53基因与腺病毒拼装成重组病毒，即基因表达载体的构建，需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶．常用的基因工程载体除动植物病毒外，还有质粒和λ噬菌体衍生物等．
（2）限制酶识别将特定核苷酸序列并切割特定的切割位点，作用对象是将磷酸二酯键切开，形成黏性末端或平末端．
（3）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存．②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入．③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择．但“今又生”药物中的腺病毒经基因工程改造后，在宿主细胞内不能复制，不能整合到染色体上．在“今义生”的生产中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的复制原点，以获得更高的安全性能．启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质．终止子也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端．因此，p53基因应插入载体的启动子和终止子之间，以便于基因的表达．
（4）PCR技术需使用Taq酶，扩增过程需要2种引物．
由图分析可知：
X基因第一次复制得到两个两种：①和②；
X基因第二次复制得到四个四种：①复制得①和③、②复制得②和④；
X基因第三次复制得到八个五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；
X基因第四次复制得到16个五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤．两个⑤得到4个⑤．    
从上面的推测可知，第三轮循环产物中才能开始出现独立且完整的X基因，即⑤．n次循环之后，只含目的基因的片段占所有扩增产物的比例为(2n-2n)/(2n)．
故答案为：
（1）限制酶和DNA连接酶    质粒和λ噬菌体衍生物等
（2）磷酸二酯    黏性末端或平
（3）复制原点    启动子和终止子
（4）Taq酶   2   (2n-2n)/(2n)