如何测定土壤中特定细菌的数量?举例说明其技术路线

Question

如何测定土壤中特定细菌的数量?举例说明其技术路线

Answer 1

显微镜直接计数法和稀释平板计数法是测定微生物数量的常用方法.直接计数法中常用的是显微镜直接计数法,这种方法是先将待测样品制成悬液,然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数(图1-3-1).根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数.直接计数法所需设备简单,可迅速得到结果,而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征,其缺点是难以计数微小的细菌.这种方法一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数.间接计数法最常用的是稀释平板计数法,它是根据微生物的培养特征而设计的计数方法.这种方法在样品中含菌数较少的情形下,也可以完成计数.应用稀释平板计数法计数时,需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液,尽量使样品中的微生物细胞分散开.再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内；或是将一定量的稀释液,与溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基混合,倾入无菌培养皿中,摇匀、静置待凝.经过培养后,就由单个微生物生长繁殖形成菌落,这样的一个菌落就代表着一个微生物个体.统计培养基中出现的菌落数,即可推算出检测样品中的活菌数.FOR EXAMPLE:] 土壤中好气性细菌的计数土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的,这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用.因此,测定土壤中的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标.材料器具土壤样品；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(附录二)、无菌水；培养皿、移液管、天平、锥形瓶、试管、酒精灯、恒温培养箱、摇床等.活动程序1.制备土壤稀释液取土壤表层5～10 cm 处的土样.准确称取1 g 土样,放入盛有99 mL 无菌水的锥形瓶(250 mL,放有小玻璃珠)中,用手或摇床振荡20 min,即制成102 倍的稀释液.用1 mL无菌移液管,吸取10 2倍稀释液0.5 mL,移入装有4.5 mL无菌水的试管中,配制成103 倍稀释液.用同样的方法可制成稀释倍数为104、105、106 的系列稀释菌液(图1-3-2).图移液时,要将移液管插入液面,吹吸3 次,每次吸上的液面要高于前一次,让菌液混合均匀并减少稀释中的误差.每配一个稀释度要换用一支移液管.2.取样及倒平板将无菌培养皿编号,依次为104、105、106,每一号码设置三个重复.用无菌移液管三支,分别吸取稀释倍数为104、105、106的土壤稀释液各0.2 mL,注入到相应编号的培养皿中(每个稀释倍数各三个培养皿).将已灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化,待冷却至45～50 ℃左右,倾入到无菌培养皿中,每皿约15 mL,轻轻转动培养皿,使土壤稀释液与培养基混合均匀.3.培养将上述接种好的平板培养基冷却后,倒置放入28～30 ℃的恒温培养箱中培养24～36 h,直至长出菌落为止.4.观察记录将实验中得到的菌落数填入表1-3-1.结果分析1.选取具有合适菌落数的稀释倍数并计数.在计算结果时,从接种的3 个稀释度中选择一个合适稀释倍数,统计出菌落数(图1-3-3).选择的原则是：过(1) 细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30～300 个菌落为宜.霉菌以每个培养皿内有10～100 个菌落为宜.(2) 同一稀释倍数各个重复的菌落数相差不太悬殊.2.将统计出的菌落数按下列公式计算,得出每克样品菌数.每克土壤样品菌数= 某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数