求半定量PCR的详细步骤 要详细到每一步喔我要用养的细胞做PCR看几个基因的表达 用的是半定量PCR 比如说A基因

Question

求半定量PCR的详细步骤 要详细到每一步喔
我要用养的细胞做PCR看几个基因的表达
用的是半定量PCR 比如说A基因

Answer 1

研究人员常常需要检测特定基因的表达水平,检测的手段很多,主要有Northern,半定量RT-PCR,荧光定量PCR(real time PCR),基因芯片的手段.很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点.
Northern方式比较直观,但是难以批量进行,劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇,因为很多实验室都可以做,但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难,内参需要与待检测基因同管扩增,但是由于内参基因表达水平太高,常常抑制检测基因的扩增,常常是分开扩,都可以扩增出来,混在一起就没有了,所以有时不能反映基因表达的实际情况.目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR,没有什么学术意义.荧光定量PCR,在学术界和临床诊断都被广泛采用,该技术能比较真实反映基因的表达水平,实时监控PCR扩增,数据处理自动化和数字化.荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增,合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针.要准雀体现表达水平,半定量RT-PCR,荧光定量PCR扩增的循环数比常规少,扩增产物一般都要求处在线性区,如果扩增过程已到达平台区,扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低.基因芯片的基本原理和Northern 基本相同,类似于点杂交,都是采用杂交原理,差别是基因芯片一般采用荧光探针,可以同时比较很多样品,可以批量处理和自动化.不足之处是检测设备费用高,假阳性的比较高,需要其他方式予以验证.