bar基因（抗除草剂基因）对除草剂PPT有抗性，来自吸水链霉菌．下列资料是抗PPT转基因棉的培育过程．资料1：根据bar基因两端已知的碱基序列，设计合成了如下引物：上游引物：5′-CGGAATT…

Question

bar基因（抗除草剂基因）对除草剂PPT有抗性，来自吸水链霉菌．下列资料是抗PPT转基因棉的培育过程．
资料1：根据bar基因两端已知的碱基序列，设计合成了如下引物：
上游引物：5′-CGGAATT…C-3′
下游引物：5′-TACAAGCTT…G-3′
PCR扩增程序为：预变性后，94℃、30S；65℃、30S；72℃、1min，共35个循环．
资料2：用EcoRI/HindⅢ双酶切PCR产物和质粒pET30后，用T₄-DNA连接酶连接，构建bar基因表达载体（pET30-bar），EcoRI识别切割G↑AATTC，HindⅢ识别切割A↑AGCTT．
资料3：将pET30-bar导入处于感受态的根癌农杆菌中，用含有卡那霉素的YEB固体培养基筛选出转化的根癌农杆菌，将其菌液加入棉花愈伤组织培养基中，20天后，再移入分化培养基诱导生芽、生根，形成试管苗后移栽．
情分析回答：
Ⅰ、根据资料1分析：

（1）目的基因的获取方法为___，在PCR扩增时，除DNA模板外，还需要Taq酶和原料，Taq酶的特点是___．
Ⅱ、根据资料2回答：
（2）用EcoRⅠ/HindⅢ对质粒和PCR产物进行双酶切得原因有___（多选）．
A．防止质粒自身环化         B．防止bar基因自身环化
C．利于bar基因的单向连接    D．抑制切割后的分子串连形成寡素物
Ⅲ、根据材料3分析：
（3）用___处理，可使根癌农杆菌进入感受态，为筛选出含bar基因的棉花愈伤组织，在愈伤组织培养基中除加入卡那霉素外，还应加入适宜浓度的___．在分化培养时，通过调节___的比例，完成对根、芽的分化诱导．

Answer 1

（1）获取目的基因的方法主要有两种：一种是从供体细胞的DNA中直接分离基因，最常用的方法是“鸟枪法”又叫“散弹射击法“；另一种是人工合成基因．在PCR扩增时，除DNA模板外，还需要Taq酶和原料，Taq酶为耐高温的DNA聚合酶，其特点是耐高温．
（2）只使用EcoRI，则质粒和目的基因两端的粘性末端相同，用DNA连接酶连接时，会导致质粒和目的基因自身环化；而利用EcoRⅠ/HindⅢ剪切时，质粒和目的基因两端的粘性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身环化．有利于bar基因的单向连接，并抑制切割后的分子串连形成寡聚物．
（3）将目的基因导入微生物细胞时，常采用感受态细胞法，即用Ca²⁺处理微生物细胞，使其成为感受态细胞，更容易吸收周围环境中的DNA分子．为筛选出含bar基因的棉花愈伤组织，需用选择培养基，即在愈伤组织培养基中除加入卡那霉素外，还应加入适宜浓度的除草剂PPT．不同的生长素和细胞分裂素的比例可影响根或芽的分化，故在分化培养时，通过调节生长素和细胞分裂素的比例，完成对根、芽的分化诱导．
故答案为：
（1）PCR扩增    耐高温
（2）ABCD
（3）Ca²⁺（CaCI₂）       除草剂PPT    生长素和细胞分裂素